Avviene nel quartiere San Lorenzo con la Casa dei Bambini, in cui applica una nuova concezione di scuola d'infanzia: Il metodo della pedagogia scientifica, volume scritto e pubblicato a Città di Castello (Perugia) durante il primo corso di specializzazione (1909). Il testo viene tradotto e accolto in tutto il mondo con grande entusiasmo. Al suo arrivo negli Stati Uniti, nel 1913, il New York Tribune la presentò come the most interesting woman of Europe (la donna più interessante d'Europa). Da quel momento, il suo metodo avrebbe riscosso un buon interesse nel Nord America, col tempo poi affievolitosi, fino al ritorno in auge sostenuto da Nancy McCormick Rambusch, fondatrice, nel 1960, della Società Montessori Americana.
Dal successo dell'esperimento romano nasce il movimento montessoriano, dal quale nel 1924 avrà origine la scuola magistrale Montessori e l'"opera Nazionale Montessori", eretta, quest'ultima, in Ente morale e volta alla conoscenza, alla diffusione, all'attuazione e alla tutela del suo metodo. Maria Montessori ne diviene Presidente onoraria.
Fu la prima donna italiana a laurearsi in Medicina.