Allieva dell'archeologo Federico Halbherr all'epoca della sua giovinezza, fu una delle prime archeologhe della Missione Archeologica Italiana a Creta (dal 1910 divenuta Scuola Archeologica Italiana di Atene) e in questa veste pubblicò l'opera del proprio maestro, le Inscriptiones Creticæ, comprendente le iscrizioni in lingua greca e latina dell'isola di Creta, tra le quali vi era la Grande Legge di Gortyna, il codice giuridico più grande che l'antichità ci abbia trasmesso. Con questa pubblicazione Margherita Guarducci si guadagnò fama internazionale.
Ottenuta nel 1931 la docenza di Epigrafia e Antichità Greche presso l'Università di Roma "La Sapienza", la mantenne fino al 1973, continuando però ad insegnare fino al 1978 alla Scuola Nazionale di Archeologia di Roma, ente di cui fu anche direttrice.
Al periodo del suo insegnamento risalgono le sue opere sulla didattica dell'epigrafia greca: i quattro volumi della Epigrafia Greca ed il volume di compendio L'epigrafia greca dalle origini al tardo Impero. Il suo nome è legato alla attribuzione, sotto la basilica di San Pietro in Vaticano, della presunta tomba dell'apostolo San Pietro.